Javascript está actualmente deshabilitado en su navegador.Varias características de este sitio no funcionarán mientras javascript esté deshabilitado.acceso abierto a la investigación científica y médicaDesde la presentación hasta la primera decisión editorial.De la aceptación editorial a la publicación.El porcentaje anterior de manuscritos han sido rechazados en los últimos 12 meses.Revistas científicas y médicas de acceso abierto revisadas por pares.Dove Medical Press es miembro de la OAI.Reimpresiones masivas para la industria farmacéutica.Ofrecemos beneficios reales a nuestros autores, incluido el procesamiento rápido de artículos.Registre sus detalles específicos y medicamentos específicos de interés y compararemos la información que proporcione con los artículos de nuestra extensa base de datos y le enviaremos copias en PDF por correo electrónico de inmediato.Volver a Revistas » International Journal of Nanomedicine » Volumen 12Autores: Hwang G, Kim H, Yoon H, Song C, Lim D, Sim T, Lee JPublicado el 26 de julio de 2017 Volumen 2017:12 Páginas 5345—5357DOI https://doi.org/10.2147/IJN.S141595Revisión por revisión por pares anónimos únicosEditor que aprobó la publicación: Dr. Thomas J WebsterGyoyeon Hwang,1,2,* Hyeonhye Kim,1,* Hojong Yoon,1 Chiman Song,1 Dong-Kwon Lim,3 Taebo Sim,1,3 Jiyeon Lee1,2 Instituto de Ciencia y Tecnología de Corea, Seúl, 2Bio-Med, Universidad de Ciencia y Tecnología de Corea, Daejeon, 3KU-KIST Graduate School of Converging Science and Technology, Universidad de Corea, Seúl, República de Corea *Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo Resumen : Los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) juegan un papel importante en la determinación de la proliferación, diferenciación, migración y supervivencia celular.Aunque se ha desarrollado una variedad de inhibidores de FGFR de molécula pequeña para la terapia del cáncer, la interacción entre los FGFR y los inhibidores de FGFR no se ha caracterizado bien.La interacción FGFR-inhibidor se puede caracterizar utilizando una nueva sonda de imagen que tiene propiedades de señal fuertes y estables para la imagen celular in situ de la interacción sin extinción.Desarrollamos una sonda de punto cuántico (QD) modificada por un inhibidor de quinasa para investigar la interacción entre el FGFR y los posibles inhibidores.Especialmente, la proteína fluorescente verde turbo-FGFR3 se sobreexpresó en células HeLa para investigar la colocalización de FGFR3 y AZD4547 utilizando la sonda QD-AZD4547.El resultado indica que esta sonda es útil para investigar los comportamientos de unión de FGFR3 con el inhibidor de FGFR.Por lo tanto, esta nueva sonda QD modificada con inhibidores es una herramienta prometedora para comprender la interacción entre el FGFR y los inhibidores y para crear futuras estrategias de detección de fármacos basadas en células y de alto contenido.Palabras clave: punto cuántico, factor de crecimiento de fibroblastos 3, AZD4547, inhibidor de la cinasa, imágenes in situLas imágenes celulares in situ han atraído una atención significativa en el campo del descubrimiento de fármacos por sus posibles aplicaciones en estudios de mecanismos, identificación de objetivos y detección de fármacos basados ​​en células.1–3 Aunque varios estudios prometedores han sugerido el uso de imágenes celulares in situ como herramienta, 4,5 La investigación de la interacción entre las proteínas diana y los fármacos con esta herramienta sigue siendo difícil debido a la falta de resolución y rendimiento.Por lo tanto, se debe introducir una nueva sonda para que las imágenes celulares in situ se conviertan en un proceso importante en el desarrollo de nuevos fármacos.Por lo tanto, esta nueva sonda debe tener alta resolución, alta estabilidad y una fuerte señal de imagen que no disminuya con el tiempo.Una estrategia para desarrollar una sonda de imágenes que pueda investigar mecanismos y apoyar el descubrimiento de fármacos es conjugar una sustancia química fluorescente con un nuevo fármaco que se una a la proteína diana en las células.Se introdujeron sondas fluorescentes de molécula pequeña para estudiar la interacción entre una proteína diana y un fármaco.6,7 Estas sondas proporcionan un método para detectar la actividad de un fármaco potencial para la inhibición de la enzima diana o para evaluar la eficacia del fármaco asociada con fenómenos biológicos.Sin embargo, no hay ninguna técnica disponible para obtener imágenes de la unión del inhibidor-quinasa in situ mientras se rastrea la interacción del inhibidor-quinasa en las células debido a la falta de sondas de imagen potentes que no se apaguen mientras se rastrean los inhibidores.Por lo tanto, se necesita una sonda con una señal altamente estable y de larga duración para evaluar la distribución del posible movimiento de fármacos en las células.Los puntos cuánticos (QD) se seleccionaron como sondas fluorescentes para conjugar con fármacos potenciales (es decir, inhibidores en nuestro estudio) debido a su alta intensidad de fluorescencia,8 fotoestabilidad9 y fácil química superficial.10Propusimos conjugados de quinasa-inhibidor-QD como sondas para imágenes celulares in situ.Las tirosina quinasas receptoras (RTK), que son proteínas transmembrana, se seleccionaron como proteínas diana para el inhibidor seleccionado, ya que la interacción se produce en la membrana celular y, por lo tanto, puede detectarse fácilmente.11 Recientemente, la señalización del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) en el cáncer ha recibido atención por su capacidad para causar angiogénesis tumoral12 al desregular los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF).Esto puede conducir a la proliferación, supervivencia y quimiorresistencia de las células tumorales.13 El inhibidor de FGFR AZD4547 es un pionero con sus resultados terapéuticos mejorados contra una variedad de modelos de cáncer desregulados de FGFR.14 Aunque muchos estudios sobre la eficacia de AZD4547 en varias células cancerosas han 15–17, no se ha abordado la interacción física entre AZD4547 y FGFR.En este estudio, preparamos la sonda QD (QD-AZD4547) modificada con inhibidor de FGFR conocido (AZD4547) para obtener imágenes de FGFR in situ para investigar la interacción entre FGFR y AZD4547 en las células.Los QD se conjugaron con AZD4547 mediante una reacción de formación de enlaces amida entre los grupos de ácido carboxílico de los QD y la amina-AZD4547 en presencia de clorhidrato de etilcarbodiimida (EDC)/sulfo-N-hidroxisulfosuccinimida (NHS).Este método de conjugación simple ha sido ampliamente utilizado para conjugar covalentemente biomoléculas a la superficie de nanopartículas. línea celular.Aunque las actividades de quinasa de AZD4547 contra FGFR fueron fuertes en FGFR1, FGFR2 y FGFR3 relativamente,14 en el presente estudio, seleccionamos solo FGFR3 para observar el patrón de colocalización específico de FGFR3-AZD4547 expresado por QD y turbo-GFP en células HeLa.Nuestro estudio confirmó que rastrear la interacción in situ del inhibidor de quinasa RTK físico con los conjugados QD-RTK es una herramienta para comprender cómo el inhibidor de RTK interactúa físicamente con RTK in situ.Además, esta herramienta mostró el potencial para ser aplicada con análisis cuantitativo basado en QD de RTK, así como imágenes in situ.20Síntesis de enlazador de amina de AZD4547 y datos de RMNTodos los reactivos químicos y disolventes se compraron a proveedores comerciales y se usaron sin purificación futura.Todas las reacciones se realizaron en atmósfera de N2 en cristalería secada a la llama.Las reacciones se controlaron mediante cromatografía en capa fina con placas de gel de sílice prerrevestidas E. Merck de 0,25 mm (60 F254).El progreso de la reacción se controló mediante análisis de cromatografía en capa fina usando una lámpara UV, ninhidrina o tinte de p-anisaldehído para fines de detección.Todos los disolventes se purificaron mediante técnicas estándar.La purificación de los productos de reacción se llevó a cabo mediante cromatografía en columna de gel de sílice utilizando Kieselgel 60 art.9385 (malla 230–400).La pureza de todos los compuestos fue superior al 95 %, y los espectros de masas y la pureza de todos los compuestos se analizaron utilizando el sistema de cromatografía líquida-espectrometría de masas de Waters (detector de matriz de fotodiodos Waters 2998, detector de masas 3100 de Waters, organizador de fluidos del sistema SFO de Waters, 2545 Binary Gradient Module, Waters Reagent Manager, Waters 2767 Sample Manager) utilizando la columna SunFireTM C18 (4,6 × 50 mm, tamaño de partícula de 5 μm): gradiente de disolvente = 60 % (o 95 %) A a 0 min, 1 % A a 5 mín.Disolvente A = 0,035 % de ácido trifluoroacético en H2O;Disolvente B = TFA al 0,035% en MeOH;caudal 3,0 (o 2,5) ml/min.Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) se obtuvieron usando un espectrómetro Bruker 400 MHz FT-NMR (400 MHz).Se utilizan abreviaturas estándar para indicar las multiplicidades de las señales.AZD4547 (N-(5-(3,5-dimetoxifenetil)-1H-pirazol-3-il)-4-((3S,5R)-3,5-dimetilpiperazin-1-il)benzamida, 66 mg, 0,142 mmol ) y 2-(6-bromohexil)isoindolin-1,3-diona (44 mg, 0,142 mmol) en dimetilformamida (DMF) seca (0,5 ml) se añadieron a trietilamina (0,03 ml, 0,213 mmol) con yoduro de potasio (24 mg , 0,142 mmol) a temperatura ambiente.A continuación, la mezcla de reacción se agitó durante 3 días a 40 ºC, se inactivó con H2O y se diluyó con acetato de etilo (EtOAc).La capa orgánica se lavó con H2O, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró a presión reducida.El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (CH2Cl2/MeOH = 93:7) para proporcionar N-(5-(3,5-dimetoxifenetil)-1H-pirazol-3-il)-4-((3S, 5R)-4-(6-(1,3-dioxoisoindolin-2-il)hexil)-3,5-dimetilpiperazin-1-il)benzamida (41 mg, 42 %) como un aceite incoloro.Este químico intermedio fue confirmado por 1H NMR.Este compuesto se añadió al hidrato de hidracina (solución al 50 %–60 %, 0,02 ml) a temperatura ambiente y luego se agitó durante 1 hora a 80 °C, y se concentró a presión reducida.La mezcla se filtró y purificó mediante cromatografía líquida preparativa de fase inversa-espectrometría de masas utilizando un gradiente de MeOH al 30 %-100 %/H2O con TFA al 0,035 % para dar el 4-((3S,5R)-4-(6- aminohexil)-3,5-dimetilpiperazin-1-il)-N-(5-(3,5-dimetoxifenetil)-1H-pirazol-3-il)benzamida (amina-AZD4547) (20 mg, 82 %) como Sal TFA y aceite incoloro.La estructura se confirmó mediante RMN 1H, que indicó que N-(5-(3,5-dimetoxifenetil)-1H-pirazol-3-il)-4-((3S,5R)-4-(6-(1, 3-dioxoisoindolin-2-il)hexil)-3,5-dimetilpiperazin-1-il)benzamida (2) tiene RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ a 8,65 (bs, 1H), 7,85–7,82 (m, 2H ), 7,77 (d, J=8,8 Hz, 2H), 7,72–7,69 (m, 2H), 7,85 (d, J=8,8 Hz, 2H), 6,59 (bs, 1H), 6,35–6,31 (m, 3H) , 3,75 (s, 6H), 3,68 (t, J=7,2 Hz, 2H), 3,57 (d, J=11,2 Hz, 2H), 2,97–2,88 (m, 4H), 2,78–2,68 (m, 6H), 1,69 (pent, J=7,2 Hz, 2H), 1,41–1,34 (m, 2H), 1,31–1,26 (m, 2H), 1,17 (s, 3H) y 1,16 (s, 3H) mientras que 4-((3S ,5R)-4-(6-aminohexil)-3,5-dimetilpiperazin-1-il)-N-(5-(3,5-dimetoxifenetil)-1H-pirazol-3-il)benzamida (3) tiene 1H RMN (400 MHz, MeOD) δ a 8,36 7,91 (d, J=8,8 Hz, 2H), 7,14 (d, J=8,8 Hz, 2H), 6,48 (s, 1H), 6,39–6,38 (m, 2H), 6,35–6,34 (m, 1H), 4,10 (dd, J=2,0 Hz, 13,6 Hz, 2H), 3,89 (t, J=7,2 Hz, 2H), 3,75 (s, 6H), 3,54–3,49 (m, 2H ), 3,03–2,89 (m, 6H), 2,86–2,79 (m, 2H), 1,73–1,68 (m, 2H), 1,66–1,62 (m, 2H), 1,44 (s, 3H), 1,42 (s, 3H) y 1,39–1,35 (m, 4H).Las actividades de la cinasa del dominio de la cinasa del FGFR3 humano (aa 436–806; Carna Biosciences, Kobe, Japón) se midieron mediante el uso de ensayos de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (TR-FRET) LANCE (PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EE. UU.) con un lector de microplacas Flexstation 3 (Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, EE. UU.).Todos los ensayos de quinasa se realizaron en un volumen final de 10 μL en placas blancas de 384 pocillos a temperatura ambiente, y las microplacas se sellaron con cintas de sellado de microplacas (Corning Incorporated, Corning, NY, EE. UU.) durante la incubación.El dominio quinasa FGFR3, ULight-poly GT (PerkinElmer Inc.) se usó como sustrato y se preparó ATP a concentraciones 4x (4 nM, 400 nM y 40 μM, respectivamente) en tampón de reacción LANCE (etilenglicol 1 mM). -bis(β-aminoetil éter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético, MgCl2 10 mM, ditiotreitol 2 mM, Tween-20 al 0,01 %, Tris-HCl 50 mM y pH 7,5).El dominio quinasa FGFR3 de 1 nM se incubó con ULight-poly GT 100 nM y diferentes concentraciones (100 μM, 30 μM, 10 μM, 3 μM, 1 μM, 300 nM, 100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 30 pM y 10 pM) de compuestos de prueba en presencia o ausencia de ATP 10 μM durante 1 h.La solución de EDTA y el anticuerpo Eu-anti-fosfo-Tyr (PT66) (PerkinElmer Inc.) se prepararon en concentraciones 4x (40 mM y 8 nM, respectivamente) en el tampón de detección LANCE 1x (PerkinElmer Inc.).La reacción de la quinasa se terminó agregando EDTA 10 mM y se incubó adicionalmente durante 5 min.Se añadió el anticuerpo anti-fosfo-Tyr (PT66) de eu a la mezcla de reacción de la quinasa a una concentración final de 2 nM para la detección de la fosforilación del sustrato, y la mezcla se incubó durante 1 h.La señal de fluorescencia se midió utilizando el lector de microplacas Flexstation 3 en modo TR-FRET (longitud de onda de excitación de 320 nm, longitud de onda de emisión de 665 nm, un tiempo de retardo de 50 μs entre la excitación y la detección de emisión, y un tiempo de integración de 100 μs).Conjugación de metoxi-QD y QD-AZD4547Qdot® 605 ITK™ Carboxyl Quantum Dots (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) (10 pmol) se conjugaron con MA(PEG)4 (metil-PEG-amina) (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.) (100 nmol ) en 450 μL de tampón de fosfato 10 mM que contiene N-(3-dimetilaminopropil)-N′-EDC (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, EE. UU.) (200 nmol) y sulfo-NHS (Pierce) (240 nmol ) a temperatura ambiente durante 3 h.La purificación se realizó utilizando un filtro centrífugo de 100 K micras (Millipore, Carrigtwohill, County Cork, Irlanda) a 6000 rpm durante 5 min tres veces.De manera similar, los QD (20 pmol) se conjugaron con amina-AZD4547 (4 nmol) en 450 μL de tampón de fosfato 10 mM usando EDC (20 nmol) y sulfo-NHS (24 nmol).La solución mixta se dejó incubar a temperatura ambiente durante 3 h.El exceso de reactivos se eliminó tres veces mediante un filtro centrífugo.Las concentraciones de QD, metoxi-QD, QD-AZD4547 y AZD4547 filtrado se determinaron midiendo la absorción UV-vis utilizando Flexstation3 (Molecular Devices LLC).El ensayo de cambio de movilidad se realizó mediante electroforesis en gel.Cada muestra se cargó en gel de agarosa al 1,5 % en tampón Tris-borato-EDTA 0,5x y se procesó a 50 V durante 90 min.El gel se observó con un transiluminador LED y el gel se tiñó con una solución de tinción azul coloidal (Thermo Fisher Scientific).La distribución del tamaño de partícula y la medición del potencial zeta se realizaron mediante Nano-ZS (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido) a temperatura ambiente.Preparación de células HeLa transfectadas con Turbo-GFP FGFR3Se cultivaron líneas celulares de adenocarcinoma de cuello uterino humano (HeLa, American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EE. UU.) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Hyclone, South Logan, UT, EE. UU.) FBS) (Hyclone) y penicilina/estreptomicina al 1 % (P/S) (Thermo Fisher Scientific).Las líneas celulares de carcinoma de vejiga humano (RT112, ATCC) se incubaron usando medio RPMI-1640 (Hyclone), que contenía FBS al 10 %, y se complementó con P/S al 1 %.La transfección se realizó utilizando ADN de plásmido FGFR3 etiquetado con Turbo GFP (Origene, Rockvile, MD, EE. UU.) y reactivo Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific).Las células HeLa se sembraron en un portaobjetos de cámara de 8 pocillos a razón de 2 x 104 células/pocillo.Después de 18 h de incubación, se trataron 3,75 μg de plásmido (plásmido [μg]: lipofectamine 2000 [μL] = 1:1) en el pozo y se incubaron durante 4 h, y luego las células se incubaron durante 24 h con DMEM que contenía 10 % FBS.Las células se transfirieron a placas de 6 pocillos para un cultivo adicional con DMEM que contenía 10 μg/1 ml de G418 (Thermo Fisher Scientific), FBS al 10 % y P/S al 1 %.Cuando se observó la cantidad de clones de células resistentes, se recogieron con tripsina al 0,25 % y luego se transfirieron a una placa de cultivo nueva utilizando una pipeta aséptica para un cultivo adicional.Después de 2 semanas de selección, las líneas celulares estables HeLa transfectadas se mantuvieron con DMEM que contenía 2 μg/ml de G418, 10 % de FBS y 1 % de P/S.Esta nueva línea celular se denominó HeLa-FGFR3.Análisis de inmunotransferencia y ensayo MTTLas células HeLa, HeLa-FGFR3 y RT112 se incubaron a 37 ° C durante 24 h y se lisaron en tampón de lisis celular NP40 (Thermo Fisher Scientific) que contenía un cóctel inhibidor de proteasa (Hoffman-La Roche Ltd., Basilea, Suiza).Las proteínas de los lisados ​​se sometieron a SDS-PAGE.Las proteínas se detectaron utilizando un anticuerpo monoclonal de conejo anti-FGFR3 (Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.), un anticuerpo monoclonal de ratón anti-GFP turbo (Origene) y un anticuerpo monoclonal de ratón anti-β actina (Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas , Texas, EE. UU.).MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio) (Sigma-Aldrich Co.) se realizó con células HeLa, HeLa-FGFR3 y RT112 después de tratar AZD4547 y amine-AZD4547 .Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas antes de añadir los fármacos.Después de 48 h de incubación con AZD4547 y amine-AZD4547, se trató la solución de MTT (1 mg/mL en medio celular completo) en cada pocillo y se incubó durante 1 h y luego se agregaron 100 μL de DMSO en cada pocillo y se incubó durante 20 min a temperatura ambiente.La absorbancia se midió utilizando Flexstation3 (Molecular Devices LLC) a una longitud de onda de 560 nm.Se utilizó el software Origin para analizar la tasa de inhibición del crecimiento a partir de tres resultados experimentales independientes.Imágenes fluorescentes y análisis de datos estadísticosLas células HeLa-FGFR3 se sembraron en un portaobjetos de cámara de 8 pocillos y se incubaron durante 24 h antes de añadir los conjugados metoxi-QD y QD-AZD4547.Se añadieron a cada pocillo 10 nM de conjugados metoxi-QD y QD-AZD4547 en medio celular completo y se incubaron durante 2 h, y luego las células se fijaron con formaldehído al 4 %.Se tomaron imágenes de las células a través del microscopio de fluorescencia Ti (Nikon Corporation, Tokio, Japón) con conjuntos de filtros FITC y Qdot 605.Las imágenes de fluorescencia se obtuvieron mediante el software de imágenes de microscopio NIS-element.Cada imagen fue analizada por el programa ImageJ con el complemento Jacop para obtener el coeficiente de colocalización FITC-QD605 de Pearson.Experimento de tratamiento con FGF y seguimiento de conjugados QDLas células HeLa-FGFR3 se sembraron en un portaobjetos de cámara de 8 pocillos y se incubaron durante 24 h, y luego se añadieron a cada pocillo QD-AZD4547 10 nM, conjugados de metoxi-QD, AZD4547 2 μM y medio celular de control en cada pocillo y se incubaron durante 30 min. .Después de la incubación, las células se lavaron y se incubaron durante 30 min con medio celular.Más tarde, 50 ng/mL de factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF1) y 20 μg/mL de heparina en medio celular se trataron en células, se incubaron durante 1 h y se fijaron con formaldehído al 4 %.Para el seguimiento temporal de metoxi-QD y QD-AZD4547 en células HeLa-FGFR3, las células se incubaron con metoxi-QD y QD-AZD4547 5 nM durante 30 min y luego se lavaron e incubaron durante diferentes tiempos y se fijaron (usando formaldehído al 4 %).Los núcleos se tiñeron con diclorhidrato de 4′,6-diamidina-2′-fenilindol (DAPI) y el Golgi se inmunotiñó con anticuerpo monoclonal de ratón anti-giantina (Abcam) y anti-ratón de cabra Alexa Fluor 594 (Thermo Fisher Scientific).Las imágenes de fluorescencia se obtuvieron a través del microscopio de fluorescencia Ti con juegos de filtros DAPI, FITC, TRITC y Qdot 605.Para conjugar AZD4547 con carboxilo QD, introdujimos un resto de amina en el compuesto AZD4547 (1) como se muestra en la Figura 1. Confirmamos amina-AZD4547 con datos de RMN que se muestran en la sección "Materiales y métodos".Figura 1 Representación esquemática de la síntesis de AZD4547 ligado a amina.Abreviaturas: TEA, trietilamina;KI, yoduro de potasio;DMF, dimetilformamida;MeOH, metanol.Para determinar si el conector de amina de amina-AZD4547 (3) exhibe un efecto de impedimento, se realizó un ensayo de quinasa con AZD4547 (1) y amina-AZD4547 (3) (Tabla 1; Figura S1).La enzima IC50 es de 7,55 nM para AZD4547 (1) y de 100,11 nM para amina-AZD4547 (3), lo que demuestra que el enlazador de amina interfiere con la unión de FGFR3-AZD4547.Sin embargo, la inhibición del crecimiento celular y la concentración efectiva de la enzima del tratamiento con amina-AZD4547 (3) no se alteran significativamente incluso si el enlazador de amina interfiere ligeramente con la unión (Figura 2).Esto es similar al estudio informado anteriormente que mostró que el anticuerpo conjugado con el fármaco no tiene efecto de cambiar la tasa de inhibición celular, aunque la inhibición del crecimiento celular con el tratamiento del enlazador del fármaco disminuyó en lugar del tratamiento con el fármaco puro.21 Por lo tanto, asumimos que la amina-AZD4547 ( 3) podría ser un AZD4547 modificado con enlazador apropiado para la conjugación con los QD.Las siguientes observaciones confirman que la amina-AZD4547 (3) se puede utilizar para observar la interacción entre FGFR3 y la sonda QD-AZD4547.Tabla 1 Valores de IC50 frente al dominio de quinasa FGFR3 Notas: Los datos se presentan como media ± SEM (n=3).*Valor IC50 bioquímico in vitro.15 Abreviaturas: IC50, la mitad de la concentración inhibitoria máxima;SEM, error estándar de la media.Figura 2 Construcción de la línea celular HeLa-FGFR3 y comparación con células RT112 y HeLa.Notas: (A) La nueva línea celular HeLa-FGFR3 expresa constantemente la fluorescencia verde de turbo-GFP.(B) Los análisis de inmunotransferencia de células HeLa, HeLa-FGFR3 y RT112 se muestran con anticuerpos específicos para FGFR3, fosfo-FGFR3, turbo-GFP y β-actina.(C) Se realizaron ensayos de proliferación celular en células HeLa, HeLa-FGFR3 y RT112 tratadas con AZD4547 y amina-AZD4547.Con AZD4547, GI50 es 1,756, 1,621 y 0,04057 μM para células HeLa, HeLa-FGFR3 y RT112, respectivamente.Con el tratamiento con amina-AZD4547, GI50 es 18,33, 11,77 y 0,1354 μM para las células HeLa, HeLa-FGFR3 y RT112, respectivamente.*P<0,05, **P<0,01 según la prueba t de Student.Abreviaturas: FGFR3, receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos;GFP, proteína fluorescente verde;p-FGFR3, receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos fosforilado;GI50, inhibición del crecimiento del 50%.Se fabricaron dos sondas para obtener imágenes de FGFR3-AZD4547 en células, QD-AZD4547 y metoxi-QD, utilizando química EDC.22,23 Metoxi-QD se seleccionó como control porque reduce la unión no específica en condiciones fisiológicas.24,25 Los pasos de conjugación se muestran en la Figura 3. Los QD de carboxilo que están hechos de nanocristales de materiales semiconductores (CdSe), que están cubiertos con una capa semiconductora adicional (ZnS), reaccionan con el resto de amina de amina-AZD4547 (3) o metoxi -PEG después de crear un grupo activador usando EDC y sulfo-NHS.La proporción óptima de metoxi-PEG y amina-AZD4547 (3) para conjugar QD se determinó mediante electroforesis en gel (datos no mostrados).Basándonos en la mayor movilidad de la electroforesis en gel, elegimos una proporción de 1:10 000 de metoxi-PEG para la sonda metoxi-QD y una proporción de 1:200 de amina-AZD4547 (3) para la sonda QD-AZD4547.Figura 3 Representación esquemática de la conjugación de la sonda QD-AZD4547 y metoxi-QD.Abreviaturas: QD, punto cuántico;EDC, clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida;sulfo-NHS, sulfo-N-hidroxisulfosuccinimida.Se usaron la distribución del tamaño de partícula, la medición del potencial zeta y la electroforesis en gel para determinar si la conjugación de metoxi-QD y QD-AZD4547 fue exitosa (Tabla 2; Figura 4).Los conjugados QD-AZD4547 y metoxi-QD son más grandes que los QD originales.Los valores de potencial zeta de QD-AZD4547 y metoxi-QD mostraron que sus cargas netas son más positivas que las de los QD debido a cada carga adicional del grupo metoxi o AZD4547.Los datos de electroforesis en gel confirmaron que las sondas QD, metoxi-QD y QD-AZD4547 tienen diferentes motilidades, y estas motilidades se correlacionaron con los valores de potencial zeta.El número de AZD4547 conjugados en QD se determinó indirectamente midiendo la absorbancia de AZD4547 en solución filtrada después de la conjugación QD.A partir de tres experimentos independientes, 86 ± 5 moléculas de AZD4547 por QD se unieron con éxito a la superficie.La concentración de QD, metoxi-QD y QD-AZD4547, se determinó por absorción UV.La intensidad de fluorescencia de los QD iniciales, metoxi-QD y QD-AZD4547, se midió relativamente a la misma concentración (Figura S2), y no hay un efecto de extinción significativo al conjugar metoxi o AZD4547 en los QD.Aunque un estudio reciente mostró que QD podría apagarse después de la conjugación de inhibidor de quinasa con una concentración creciente de inhibidores de quinasa.26 AZD4547 y metoxi en metoxi-QD y QD-AZD4547 podrían tener una concentración más baja que el resultado informado.Tabla 2 Tamaño hidrodinámico y datos de potencial zeta Nota: El tamaño hidrodinámico y el potencial zeta se obtuvieron mediante análisis DLS.Abreviaturas: QD, punto cuántico;DLS, dispersión de luz dinámica;N/A, no aplicable.Figura 4 Caracterización de las sondas metoxi-QD y QD-AZD4547.Notas: (A) Las distribuciones de tamaño hidrodinámico se midieron mediante DLS.(B) Ensayo de cambio de movilidad de electroforesis en gel de sondas QD, metoxi-QD y QD-AZD4547 (izquierda: luz UV, derecha: tinción con azul coloidal).Abreviaturas: QD, punto cuántico;DLS, dispersión de luz dinámica;ultravioleta, ultravioleta.Ensayo de proliferación celular de HeLa y HeLa-FGFR3 mediante el tratamiento con AZD4547 y amine-AZD4547Construimos una nueva línea celular para observar la unión in situ de AZD4547 a FGFR3 en las células.Se cultivaron células HeLa transfectadas con el plásmido Turbo GFP-FGFR3 con G418 que expresa la estabilidad de los genes.Además, las células HeLa fluorescentes verdes se seleccionaron mediante microscopía de fluorescencia y se denominaron HeLa-FGFR3.Las células HeLa-FGFR3 expresan constantemente fluorescencia verde y exhiben una morfología robusta, como se muestra en la Figura 2A.Para medir el nivel de expresión de FGFR3, se realizó inmunotransferencia, que mostró que las células HeLa-FGFR3 sobreexpresaron FGFR3 (~ 90 kDa) y turbo-GFP-FGFR3 (~ 110–130 kDa) (Figura 2B).Antes de observar la interacción entre las sondas y los FGFR3 mediante imágenes celulares, se midieron las tasas de proliferación de células HeLa y HeLa-FGFR3 en presencia del AZD4547 original (1) o la amina-AZD4547 sintetizada (3).Curiosamente, las células HeLa-FGFR3 son ligeramente más sensibles tanto a AZD4547 (1) como a amina-AZD4547 (3) que las células HeLa (inhibición del crecimiento del 50 % [GI50]: 1,756, 1,621 μM para HeLa y HeLa-FGFR3 con tratamiento con AZD4547 , GI50: 18,33, 11,77 μM en HeLa, HeLa-FGFR3 con tratamiento con amina-AZD4547) (Figura 2C).El efecto de impedimento de la amina-AZD4547 (3) en las células HeLa y HeLa-FGFR3 está de acuerdo con los resultados del ensayo MTT para la línea celular RT112 con FGFR3 sobreexpresado.Esto confirmó que FGFR3 interactuaría con la amina-AZD4547 (3) a través del mismo mecanismo de interacción entre FGFR3 y AZD4547.Imágenes del movimiento FGFR3 bajo unión FGFR3-FGFPara evaluar si los conjugados QD-AZD4547 fabricados realmente funcionan y se unen a FGFR3, las células HeLa-FGFR3 se trataron con la misma cantidad molar de metoxi-QD y QD-AZD4547 (Figura S3).En el caso de la sonda QD-AZD4547, la fluorescencia verde que indica FGFR3 y la fluorescencia roja que indica las sondas QD se superponen y forman una fluorescencia amarillenta por colocalización, en contraste con metoxi-QD en las células HeLa-FGFR3.La unión de QD-AZD4547 a FGFR3 basada en la colocalización de QD-GFP se analizó estadísticamente utilizando el coeficiente de Pearson (Figura S4).Se examinaron cientos de células (n=100), y los resultados de los tratamientos con sonda metoxi-QD y QD-AZD4547 no fueron diferentes entre sí, a pesar de las diferencias en las imágenes.Realizamos un experimento de tratamiento con FGF para determinar si la sonda QD-AZD4547 realmente se une a los FGFR en las células.Se usó FGF1 para este experimento de unión de ligando-receptor porque FGF1 se une bien a FGFR327 y los complejos de ligando-receptor se pueden internalizar. La Figura 5 demuestra el movimiento endocítico de FGFR3 después de incubar con FGF1 durante 1 h.Las células HeLa-FGFR3 pretratadas con sondas AZD4547 y QD-AZD4547 puras no mostraron un movimiento endocítico de FGFR3.La concentración de AZD4547 puro tratado fue de 2 μM, que es mucho mayor que la cantidad de AZD4547 en una dispersión conjugada de QD-AZD4547 10 nM porque la concentración estimada de AZD4547 es de 860 nM en QD-AZD4547 10 nM según el número de AZD4547 por QD.Aunque la concentración final de AZD4547 en QD-AZD4547 es menor que la del tratamiento con AZD4547 puro, estos resultados indican que QD-AZD4547 se une a FGFR3 e inhibe la fosforilación de FGFR3 de modo que no hay endocitosis.Por lo tanto, la sonda QD-AZD4547 se une estrictamente a los FGFR3 en las células, de modo que la unión fuerte no puede alterarse por la unión del ligando al receptor.Figura 5 Movimiento de FGFR3 en células HeLa-FGFR3 bajo la unión de FGFR3-FGF.Notas: (A) QD-AZD4547 se une específicamente a la región intracelular de FGFR3 e impide la endocitosis de FGFR3 cuando FGF forma la unión ligando-receptor, mientras que metoxi-QD muestra movimiento endocítico.(B) Representación esquemática de los diferentes movimientos de la sonda QD-AZD4547 (arriba) y metoxi-QD (abajo).La barra de escala es de 20 μm.Abreviaturas: FGFR3, receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos;FGF, factor de crecimiento de fibroblastos;QD, punto cuántico.En la mayoría de las células de mamíferos, la endocitosis mediada por receptores es un mecanismo de endocitosis en el que los receptores de la superficie celular se unen e internalizan.En el caso de la unión de FGFR3-FGF, dos ligandos de FGF y dos cadenas de sulfato de heparina se unen a dos FGFR329. El complejo formado por dimerización provoca la transfosforilación por parte de las quinasas en varios residuos de tirosina en la parte intracelular de los FGFR3, activando cascadas de señalización aguas abajo. 11 Después de la activación, el complejo se internaliza por endocitosis30 y se transporta a los lisosomas para su degradación.29 Sin embargo, AZD4547 puede retardar este proceso cuando se une a FGFR, incluso en presencia de FGF.Esto se debe a la etapa temprana de la unión de AZD4547 al sitio competitivo de ATP de FGFR3, donde AZD4547 impide la fosforilación e internalización de FGFR3 incluso si existe el estímulo de FGF.La fosforilación de tirosina de RTK permite cierto reclutamiento de moléculas adaptadoras endocíticas y provoca la internalización de RTK.31 Además, este obstáculo tuvo una eficacia superior cuando se usaron sondas QD-AZD4547 en lugar de AZD4547.La concentración absoluta de AZD4547 en las sondas QD-AZD4547 y AZD4547 libre no son comparables debido a la dificultad de medir compuestos conjugados en la superficie QD.Sin embargo, la captación celular adicional de QDs32 puede facilitar la unión de AZD4547 a FGFR3 e inducir la internalización de FGFR3 por endocitosis incluso si no todo el AZD4547 utilizado en la reacción de conjugación está conjugado con QD.Por lo tanto, demostramos diferentes procesos de internalización de FGFR de las sondas metoxi-QD y QD-AZD4547 e investigamos más la unión e internalización de FGFR-FGF.Seguimiento de imágenes in situ de la sonda metoxi-QD y QD-AZD4547 en células HeLa-FGFR3Confirmamos la conjugación exitosa de amina-AZD4547 a QD y la unión de la sonda QD-AZD4547 a FGFR3 en las células.Aunque el análisis de colocalización de QD-GFP en células HeLa-FGFR3 no mostró una diferencia significativa entre metoxi-QD y QD-AZD4547 después de un tratamiento de 2 h, las vías de endocitosis y unión inicial de cada sonda son diferentes.Mediante el seguimiento del movimiento QD a lo largo del tiempo a partir de la unión inicial, la posición de cada sonda se puede visualizar in situ.Las células HeLa-FGFR3 con metoxi-QD y QD-AZD4547 se incubaron durante 6 h (Figura 6).Cada una de las sondas QD se incubó durante 30 min antes de lavarlas e incubarlas en tiempos diferentes.Observamos el movimiento de metoxi-QD y permaneció en la membrana celular o se separó y dispersó de la membrana celular (Figura 6A).Mientras tanto, QD-AZD4547 se internalizó y se reunió cerca de los núcleos celulares a medida que pasaba el tiempo (Figura 6B).Metoxi-QD inicialmente se une a la membrana celular, pero se desprende con el tiempo ya que no tiene una unión fuerte o específica.Por el contrario, la sonda QD-AZD4547 se une específicamente a FGFR3 y se mueve a lo largo de las pistas de FGFR3 durante mucho tiempo antes de llegar finalmente a los núcleos celulares.Figura 6 Seguimiento del movimiento QD de células HeLa-FGFR3.Notas: (A) El metoxi-QD está disperso en la membrana celular.(B) La sonda QD-AZD4547 se internaliza y se reúne en los núcleos con el tiempo.La barra de escala es de 20 μm.Rojo: QD, verde: turbo-GFP-FGFR3, azul: DAPI (núcleos).Abreviaturas: QD, punto cuántico;FGFR3, receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos;GFP, proteína fluorescente verde;DAPI, 4',6-diamidino-2-fenilindol.Los autores no reportan conflictos de intereses en este trabajo.Farmacia.Nat Rev Descubrimiento de drogas.Curr Opin Biotecnología.Org Biomol Chem.J Am Chem Soc.Métodos Nat.Nat Biotechnol.Nat Mater.Célula.J Cell Physiol.Cáncer Res.Mol Cáncer Ther.Clin Cáncer Res.Clin Cáncer Res.Langmuir.Philos Trans A Math Phys Eng Sci.Protocolo Nat.Biomateriales.Bioconjug Chem.Bioconjug Chem.J Biol Chem.J Biol Chem.Más uno.Soy J Physiol Endocrinol Metab.Toxicol Sci.Este trabajo está publicado y autorizado por Dove Medical Press Limited.Los usos no comerciales del trabajo están permitidos sin ningún otro permiso de Dove Medical Press Limited, siempre que el trabajo se atribuya correctamente.Las opiniones expresadas en todos los artículos publicados aquí pertenecen a los autores específicos y no reflejan necesariamente los puntos de vista de Dove Medical Press Ltd o cualquiera de sus empleados.Reservados todos los derechos.Registrado en Inglaterra y Gales.Si acepta nuestro uso de cookies y el contenido de nuestra Política de privacidad, haga clic en 'aceptar'.